Forschungsprojekte

In unserer Gruppe untersuchen wir Struktur und Funktion von Von-Willebrand-Faktor A (VWA) Domänen enthaltenden Proteinen. Wir stellen rekombinante Proteine und deren Fragmente in eukaryotischen und prokaryotischen Expressionssystemen her. Neben der Anwendung für die strukturelle und funktionelle Analyse werden die Proteine auch zur Herstellung von spezifischen Antikörpern verwendet, die dann zu einer ausführlichen Untersuchung der Gewebeverteilung der Antigene genutzt werden. Die rekombinanten Proteine werden mittels CD Spektroskopie auf ihre Faltung und thermische Stabilität hin untersucht.

Protein-Protein Wechselwirkungen werden mit Bindungsassays im ELISA Stil und mit Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie untersucht, um Einblicke in die Beteiligung der Proteine am supramolekularen Aufbau der extrazellulären Matrix zu erhalten. Die Struktur bestimmter Domänen wird mittels NMR, SAXS und Röntgenkristallographie. Mit zielgerichteter Mutagenese untersuchen wir die Folgen von krankheitsauslösenden Mutationen auf zellulärer und molekularer Ebene.

Durch "knockout" Experimente in der Maus und eine vorübergehende Ausschaltung von Genen ("knockdown") in Zebrafischembryonen versuchen wir Einblicke in die biologische Funktion unserer Proteine zu bekommen. Unserere Forschung soll zu einem besseren Verständnis der Funktion einer bestimmten Gruppe von extrazellulären Matrixproteinen führen und dazu beitragen zu verstehen wie sie an der Entstehung von Erkrankungen wie Multiple Epiphysäre Dysplasie (MED) oder Kollagen VI abhängigen Muskeldystrophien beteiligt sind.

Kollagen VI

Kollagen VI Mikrofibrillen sind in der extrazellulären Matrix (EM) von muskuloskelettalen Geweben weit verbreitet und verbinden dort große interstitielle Strukturen und Zellen. Mutationen führen zu Bethlem Myopathie und Kongenitaler Muskeldystrophie Typ Ullrich, außerdem wird Kollagen VI bei Osteoarthrose verstärkt gebildet. Ferner wurde kürzlich einem 7 kDa-Fragment, Endotrophin genannt, eine Wirkung als Adipokin zugewiesen, das Tumorwachstum, Fibrose, Entzündung und Insulinresistenz verstärken kann. Die Struktur von Kollagen VI ist ungewöhnlich. Die Proteinketten weisen nur eine kurze Tripelhelix auf, es überwiegen Tandemanordnungen von globulären, von Willebrand-Faktor-Typ-A-enthaltenden (VWA) Domänen, die häufig Liganden über Metallionen binden. Drei verschiedene Ketten verbinden sich intra- und extrazellulär in einer komplexen, nur teilweise verstandenen Abfolge von Interaktionen zwischen den Ketten und von proteolytischen Spaltungen. Sezerniert wird ein Tetramer mit einer Masse von etwa 2200 kDa, gebildet aus heterotrimeren Monomeren. Die Mikrofibrillen enthalten weitere kovalent oder nicht-kovalent gebunden Proteine. Unser Ziel ist es, die Wechselwirkungen, den Aufbau und den Abbau aufzuklären, um Pathomechanismen von Kollagen-VI abhängigen muskuloskelettalen Erkrankungen wie z.B. Myopathien und Osteoarthrose zu verstehen, um so die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze anzustoßen. Wir exprimieren einzelne oder Tandemanordnungen von Domänen in großer Menge in Bakterien und eukaryotischen Zellen, um Kristallisierungsversuche und SAXS-Messungen durchzuführen, um für den Zusammenbau der Ketten genutzte Oberflächen zu lokalisieren. Wir konzentrieren uns auf die VWA Domänen und die Bestimmung der proteolytische Spaltstellen. Ein kritischer Schritt im intrazellulären Zusammenbau ist die Dimerisierung von zwei heterotrimeren Monomeren durch eine Wechselwirkung zwischen einer VWA Domäne und einer bestimmten tripelhelikalen Region. Tatsächlich häufen sich dort Mutationen, die zu schweren Myopathiephänotypen führen. Kollagen VI Mutationen enthaltende, von Patienten abstammende Fibroblastenzelllinien oder mittels CRISPR-Cas manipulierte Fibroblasten- oder Chondrozytenzelllinien werden verwendet, um erkrankungsrelevante Schritte im Aufbau zu identifizieren, die Interaktionen von VWA Domänen oder proteolytische Spaltungen betreffen. Zellkulturen, Zelllysate und Überstände werden mittels Immunhistochemie und Western Blots unter Verwendung eines Reihe von Antikörpern gegen alle globulären, VWA-Domänen enthaltenden Regionen untersucht. Um die proteolytische Spaltung zu analysieren, haben wir einen affinitätsgereinigten Antikörper gegen Endotrophin erzeugt. Schließlich ermöglicht die Bestimmung von wichtigen Interaktions- und Spaltstellen und deren Mutation durch CRISPR-Cas die Erzeugung von Mauslinien um Pathomechanismen in vivo zu untersuchen.

AMACO

Extrazelluläre mikrofibrilläre und filamentöse Suprastrukturen kontrollieren Gewebeintegrität und Zellschicksal. Wir werden die Wechselwirkungen der neuentdeckten AMACO-enthaltenden Suprastruktur, die Zusammensetzung der AMACO-enthaltenden Suprastruktur, deren zelluläre Rezeptoren sowie deren Integration in den Fraser-Komplex untersuchen. Die Funktion von AMACO wird in einem Mausmodell untersucht. Das Potential der Suprastrukturmoleküle als Tumormarker wird an Tumorproben untersucht.